Сорғы-зондты микроскопия - Pump-probe microscopy

Сорғы-зондты микроскопия Бұл сызықтық емес оптикалық қолданылған бейнелеу модальділігі фемтохимия оқу химиялық реакциялар. Ол эндогенді флуоресцентті емес нысандардан жоғары контрастты кескіндер жасайды. Оның көптеген қосымшалары бар, соның ішінде материалтану, дәрі, және өнерді қалпына келтіру.

Артықшылықтары

Микроскопистер қолданатын сызықты емес сіңірудің классикалық әдісі шартты болып табылады екі фотонды флуоресценция, онда фотоэлектронды қоздыру үшін бір көзден алынған екі фотон өзара әрекеттеседі. Содан кейін электрон фотонды өзінің бастапқы күйіне өткен кезде шығарады. Бұл микроскопия әдісі үш өлшемді оптикалық секциялау қабілетіне байланысты биологиялық ғылымдарда революциялық болды.

Екі фотонды сіңіру болып табылады бейсызық процесс: люминесценттік шығыс қарқындылығы қоздыру жарық қарқындылығының квадратына пропорционалды. Бұл флуоресценцияның тек лазер сәулесінің фокусында пайда болуын қамтамасыз етеді, өйткені фотоэлектронды қоздыру үшін осы жазықтықтың сыртындағы қарқындылық жеткіліксіз.[1]

Алайда, бұл микроскоптың модальділігі табиғи түрде екеуінен де өтетін биологиялық молекулалар санымен шектеледі екі фотондық қозу және флуоресценция.[2]

Сорғы-зондты микроскопия қоздыру жарығын тікелей өлшеу арқылы бұл шектеуді айналып өтеді. Бұл релаксация кезінде флуоресцентті болмаса да, екі фотонды сіңіруге қабілетті кез-келген молекулаға потенциалды мақсат санын көбейтеді.[3] Әдіс а амплитудасын модуляциялайды импульсті лазер мақсатты молекуланы an-ге дейін жеткізу үшін сорғы деп аталатын сәуле қозған күй. Содан кейін бұл екі сәуленің молекуламен өзара әрекеттесуіне негізделген зонд деп аталатын екінші когерентті сәуленің қасиеттеріне әсер етеді. Содан кейін бұл қасиеттерді кескін қалыптастыру үшін детектор арқылы өлшейді.

Сорғы-зонд микроскопиясының физикасы

Сорғы-зондты микроскопия флуоресцентті нысандарға сүйенбейтіндіктен, модальділік мультифотонды сіңірудің бірнеше түрлі типтерін пайдаланады.

Екі фотонды сіңіру

Екі фотонды сіңіру (TPA) - бұл екі фотон бір мезгілде бірдей молекуламен жұтылатын үшінші ретті процесс. Егер екінші фотонды бір кванттық оқиға шеңберінде бірдей электрон жұтса, электрон ан-ға енеді қозған күй.[4]

Бұл қолданылған бірдей құбылыс екі фотонды микроскопия (TPM), бірақ сорғы-зондтық микроскопияны TPM-ден ажырататын екі негізгі ерекшелік бар. Біріншіден, молекула міндетті түрде люминесцентті а емес фотодетектор зондтың қарқындылығын өлшейді. Сондықтан TPM керісінше, екі фотонды сіңіру пайда болған кезде сигнал азаяды.[3]

Екіншіден, сорғы зондтарының микроскопиясында әр фотон үшін спектрлік бөлінген көздер қолданылады, ал әдеттегі TPM бір толқын ұзындығының бір көзін пайдаланады. Бұл дегенеративті екі фотонды қозу деп аталады.[3]

Қозған күйдегі сіңіру

Қозған күйдегі сіңіру (ESA) сорғы сәулесі электронды қозған күйге жіберген кезде пайда болады, содан кейін зонд сәулесі электронды жоғары қозған күйге жібереді. Бұл TPA-дан, ең алдымен, пайда болған уақыт шкаласында ерекшеленеді. Себебі электрон қозғалған күйде белгілі бір уақыт аралығында бола алады наносекундтар, демек, TPA-ға қарағанда импульстің ұзақ мерзімдерін қажет етеді.[5]

Ынталандырылған шығарылым

Сорғы-зондты микроскопия да өлшей алады ынталандырылған эмиссия. Бұл жағдайда сорғы сәулесі электронды қозған күйге келтіреді. Содан кейін, электрон зонд сәулесінің әсерінен фотон шығарады. Бұл өзара әрекеттесу детектор учаскесіндегі зонд сигналын күшейтеді.

Жердегі сарқылу

Негізгі жағдай сарқылу сорғының сәулесі электронды қозған күйге жібергенде пайда болады. Алайда, ESA-дан айырмашылығы, зонд сәулесі электронды екінші қозған күйге жібере алмайды. Керісінше, ол қалған электрондарды негізгі күйден бірінші қозған күйге жібереді. Алайда, сорғы сәулесі бастапқы күйдегі электрондар санын азайтқандықтан, зонд фотоны аз жұтылады және детектор орнында зонд сигналы артады.[3]

Айқас фазалық модуляция

Фазалық модуляция себеп болады Керр әсері: онда сыну көрсеткіші Үлкен электр өрісі болған кезде өзгереді.[6] Бұл жағдайда сорғы сәулесі зондтың фазасын модуляциялайды, содан кейін оны өлшеуге болады интерферометриялық әдістер. Белгілі бір жағдайларда, деп аталады спектрлік ығысу фазалық модуляция, бұл фазалық өзгеріс спектрлік фильтрмен анықталатын сорғы спектрінің өзгеруін тудырады.[3]

Оптикалық дизайн

Қозу

Өлшеу бейсызық оптикалық өзара әрекеттесу лездік қуаттың жоғары деңгейін және өте дәл уақытты қажет етеді. Нәзік үлгілердің бүлінуіне жол бермей, осы өзара әрекеттесуді тудыруға қажетті фотондардың көп мөлшеріне жету үшін бұл микроскоптар бұғатталған лазер. Бұл лазерлер өте жоғары фотон санына қол жеткізе алады фемтосекунд уақыт шкаласы және орташа қуатты сақтау. Көптеген жүйелер а Ти: Саф ол қол жеткізе алатын толқын ұзындықтарының кеңістігі арқасында ортаға ие болады.[3][7]

Әдетте, сорғы мен зондты генерациялау үшін бірдей көз қолданылады. Ан оптикалық параметрлік осциллятор (OPO) зонд сәулесін қажетті толқын ұзындығына айналдыру үшін қолданылады. Зонд толқынының ұзындығын спектроскопиялық қолдану үшін үлкен диапазонда реттеуге болады.[7]

Алайда, екі фотонды өзара әрекеттесудің жекелеген түрлері үшін бөлек импульсті көздерді қолдануға болады.[3] Бұл электрондардың қозған күйінде бірнеше пикосекунд ішінде болатын қозған күйді сіңіру сияқты өзара әрекеттесу кезінде ғана мүмкін болады. Алайда, сорғы мен зонд сәулелері арасындағы уақытты модуляциялау үшін ұзындығы әр түрлі екі сәулелік жолдары бар бір фемтосекундтық көзді қолдану жиі кездеседі.[3][7]

Сорғы сәулесінің амплитудасы an көмегімен модуляцияланады акустикалық-оптикалық немесе электр-оптикалық модулятор 10 бұйрығы бойынша7 Hz. Содан кейін сорғы мен зонд сәулелері a көмегімен қайта біріктіріледі дихролық сплиттер және үлгіге бағытталмас бұрын кескінді нүктелік генерациялау үшін гальванометриялық айна көмегімен сканерленген.[3]

Анықтау

Зондты модуляциялау кезінде пайда болған сигнал бастапқы сорғы сәулесінен әлдеқайда аз, сондықтан екеуі анықтау жолында спектральды түрде бөлінеді дихролық айна. Зонд сигналын көптеген түрлерімен жинауға болады фотодетектор, әдетте а фотодиод. Содан кейін, модуляцияланған сигнал a көмегімен күшейтіледі күшейткіш сорғының модуляция жиілігіне реттелген.[3]

Мәліметтерді талдау

Гиперспектральды деректерді талдауға ұқсас, кешіктірілген стек деп аталатын сорғы-зондты бейнелеу деректерін негізгі молекулалық түрлердің молекулалық контрастылы кескін алу үшін өңдеу керек.[3] Сорғы-зонд деректерін өңдеу бірнеше себептерге байланысты қиынға соғады - мысалы, сигналдар биполярлы (оң және теріс), көп экспоненциалды және химиялық ортаның нәзік өзгеруімен айтарлықтай өзгеруі мүмкін.[8][9] Сораптық-зондтық деректерді талдаудың негізгі әдістері - көп экспоненциалды фитинг, негізгі компоненттерді талдау және фазорлық талдау.[3][7]

Көп экспоненциалды фитинг

Көп экспоненциалды фитингтерде уақыт бойынша шешілген қисықтарға ан орнатылған экспоненциалды ыдырау ыдырау тұрақтылықтарын анықтайтын модель. Бұл әдіс қарапайым болғанымен, оның дәлдігі төмен.[7]

Негізгі компоненттерді талдау

Негізгі компоненттерді талдау (PCA) сорғы зондтарының деректерін талдау үшін қолданылатын алғашқы әдістердің бірі болды, өйткені ол әдетте гиперпектрлік деректерді талдау үшін қолданылады. PCA деректерді ортогоналды компоненттерге бөледі. Жылы меланома зерттеулер, негізгі компоненттер әртүрлі формалардан алынған сигналдармен жақсы келісімді көрсетті меланин.[10] PCA-дің артықшылығы - шудың деректердің дисперсиясының көп бөлігін құрайтын негізгі компоненттерді ғана сақтау арқылы азаюы. Алайда, негізгі компоненттер міндетті түрде ортогоналды емес негізгі химиялық түрлердің нақты қасиеттерін көрсетпейді.[3] Сондықтан шектеу PCA көмегімен бірегей химиялық түрлердің санын анықтау мүмкін емес.[3]

Фазорлық талдау

Фазорлық талдау үшін әдетте қолданылады флуоресцентті өмір бойы бейнелеу микроскопиясы (FLIM) деректерді талдау.[11] және сорғы-зондты бейнелеу деректерін талдауға бейімделген [8] Сигналдар олардың нақты және ойдан шығарылған бөліктеріне бөлінеді Фурье түрлендіруі берілген жиілікте. Нақты және ойдан шығарылған бөліктерді бір-біріне қарсы тұрғызу арқылы әр түрлі бөлу хромофорлар нақты өмір сүру уақыттарын картаға түсіруге болады.[3][7] Меланома зерттеулерінде бұл тәсіл меланиннің әртүрлі формаларын ажырата алатындығын тағы көрсетті.[8] Фазорлық талдаудың басты артықшылықтарының бірі - бұл мазмұнның интуитивті сапалы, графикалық көрінісін қамтамасыз етеді[7] Ол сандық талдау үшін PCA-мен біріктірілген.[12]

Қолданбалар

Жоғары жылдамдықты және жоғары сезімталдықты сораптық-зондтық бейнелеу техникасының дамуы материалтану, биология және өнер сияқты бірнеше салаларда қолдануға мүмкіндік берді.[3][7]

Материалтану

Сорғы-зондты бейнелеу графен сияқты наноматериалдарды зерттеу және сипаттау үшін өте қолайлы,[13] нанокүтіктер,[14] наноқуаттар,[15] және әр түрлі жартылай өткізгіштер,[16][17] олардың үлкен сезімталдығына байланысты, бірақ флуоресценциясы әлсіз. Атап айтқанда, бір қабырғалы көміртекті нанотүтікшелер резолюцио.м субмикрометрімен кеңінен зерттелген және бейнеленген,[18] тасымалдаушының динамикасы, фотофизикалық және фотохимиялық қасиеттері туралы мәліметтер беру.[19][20][21]

Биология

Биологиядағы сорғы-зондты техниканың алғашқы қолданылуы бояумен таңбаланған жасушаның ынталандырылған эмиссиясын in vitro бейнелеу болды.[22] Сорғы-зондты бейнелеу меланинді бейнелеу үшін меланиннің екі негізгі формасын ажырату үшін кеңінен қолданылады - эумеланин (қоңыр / қара) және феомеланин (қызыл / сары).[23] Меланомада эумеланин айтарлықтай жоғарылайды. Сондықтан эумеланин мен феомеланиннің таралуын суретке түсіру қатерсіз зақымданулар мен меланоманы жоғары сезімталдықпен ажыратуға көмектеседі[24]

Өнер

Көркем туынды көпшіліктен тұрады пигменттер олардың түсін анықтайтын спектрлік сіңіру қасиеттерінің кең спектрімен. Осы пигменттердің кең спектрлік ерекшеліктеріне байланысты қоспадағы белгілі бір пигментті анықтау қиынға соғады. Сорғы-зондты бейнелеу дәл, жоғары ажыратымдылықты, молекулалық ақпаратты бере алады[25] және тіпті бірдей визуалды түске ие болуы мүмкін пигменттерді ажыратыңыз.[26]

Әдебиеттер тізімі

  1. ^ Денк, Уинфрид, Джеймс Х. Стриклер және Уатт В. Уэбб. «Екі фотонды лазерлік сканерлеу флуоресценциясының микроскопиясы.» Ғылым248.4951 (1990): 73-76.
  2. ^ Зипфел, Уоррен Р., Ребекка М. Уильямс және Уатт В. Уэбб. «Сызықты емес сиқыр: биоқылымдардағы мультипотонды микроскопия». Табиғи биотехнология 21.11 (2003): 1369.
  3. ^ а б c г. e f ж сағ мен j к л м n o б Фишер, Мартин С .; Уилсон, Джесси В .; Роблес, Франсиско Е .; Уоррен, Уоррен С. (2016). «Шақырылған шолу мақаласы: сорғы зондтарының микроскопиясы». Ғылыми құралдарға шолу. 87 (3): 031101. Бибкод:2016RScI ... 87c1101F. дои:10.1063/1.4943211. ISSN  0034-6748. PMC  4798998. PMID  27036751.
  4. ^ Диаспро, Альберто, Джузеппе Чирико және Маддалена Коллини. «Екі фотонды флуоресценцияны қоздыру және соған байланысты биологиялық микроскопия әдістері». Биофизиканың тоқсандық шолулары 38.2 (2005): 97-166.
  5. ^ Чжоу, Гуангён және т.б. «ПМПИ органикалық бояғыштың екі фотонды сіңіру және қозған күйдегі сіңіру қасиеттері». Оптикалық байланыс 241.1-3 (2004): 215-219.
  6. ^ Салех, Бахаа Е.А., Мальвин Карл Тейх. Фотоника негіздері. Том. 22. Нью-Йорк: Вили, 1991 ж.
  7. ^ а б c г. e f ж сағ Донг, Пу-Тинг және Джи-Син Чен. «Сорғы-зонд микроскопиясы: теория, аспаптар және қолдану. «Спектроскопия 32.4 (2017): 2-11.
  8. ^ а б c Роблес, Франсиско Э. және т.б. «Сызықтық емес сорғы-зондты микроскопияға арналған фазорлық талдау». Optics Express 20.15 (2012): 17082-17092.
  9. ^ Симпсон, Мэри Джейн және т.б. «Меланиндердің инфрақызыл қоздырылған күй динамикасы: темір құрамының әсері, фото-зақымдану, химиялық тотығу және агрегат мөлшері». Физикалық химия журналы А 118.6 (2014): 993-1003.
  10. ^ Мэттьюс, Томас Э. және т.б. «Помпалы-зондты бейнелеу меланоманы меланоцитарлық неврден ажыратады». Science Translational Medicine 3.71 (2011): 71ra15-71ra15.
  11. ^ Дигман, Мишель А. және т.б. «Флуоресценттік өмір бойы бейнені талдаудың фазорлық тәсілі». Биофизикалық журнал 94.2 (2008): L14-L16.
  12. ^ Роблес, Франсиско Э. және т.б. «Пигментті тері меланомасының алғашқы зақымдануларын сорғы-зондпен бейнелеу метастатикалық потенциал туралы түсінік береді». Биомедициналық оптика экспресс 6.9 (2015): 3631-3645.
  13. ^ Ли, Джунджи және т.б. «Графен мен графен оксидінің тірі жасушалардағы және айналымдағы қандағы жоғары сезімталдықты абсорбциялық сіңіру бейнесі». Ғылыми баяндамалар 5 (2015): 12394.
  14. ^ Сталева, Христина; Хартланд, Григорий В. (2008). «Бір бөлшектік өтпелі абсорбциялық спектроскопиямен зерттелген күміс нанокүтіктер мен нановирлердің тербелмелі динамикасы». Жетілдірілген функционалды материалдар. 18 (23): 3809–3817. дои:10.1002 / adfm.200800605. ISSN  1616-301X.
  15. ^ Ло, Шун Шанг және т.б. «Ауалық нановирлерде плазмонның қозу дәрежесін сорғы-зондтық микроскопияны қолдану арқылы бейнелеу». Оптика хаттары 38.8 (2013): 1265-1267.
  16. ^ Вонг, Кэти Ю. және т.б. «Экзитон динамикасын кіші молекулалы органикалық жартылай өткізгіш пленкада субдомендік өтпелі абсорбциялық микроскопиямен ашу». Физикалық химия журналы С 117.42 (2013): 22111-22122.
  17. ^ Полли, Дарио және т.б. «Фемтосекундтық насостың полимерлі қоспалардағы интерфейс динамикасын наноскальдық кескіндеу ‐ Зондтың конфокальды микроскопиясы». Жетілдірілген материалдар 22.28 (2010): 3048-3051.
  18. ^ Тонг, Линг және т.б. «Уақытша абсорбциялық микроскопияны қолдана отырып, жасушалар мен тышқандардағы жартылай өткізгішті және метал көміртекті нанотүтікшелерді жапсырмасыз бейнелеу». Nature Nanotechnology 7.1 (2012): 56.
  19. ^ Лор, Жан-Себастиан және т.б. «Бір қабырғалы көміртекті нанотүтікшелердегі ультра жылдамдықты тасымалдаушы динамикасы». Физикалық шолу хаттары 90.5 (2003): 057404.
  20. ^ Парк, Джэхонг, Правас Дерия және Майкл Дж. «Бір қабырғалы көміртекті нанотүтікшенің динамикасы мен сіңірілуінің спектрлік қолтаңбасы электронды қоздырылған триплет күйі». Американдық химиялық қоғам журналы 133.43 (2011): 17156-17159.
  21. ^ Джунг, Ёукюн және т.б. «Уақытша-абсорбциялық оптикалық микроскопты қолданып, жеке бір қабырғалы көміртекті нанотүтікшелердің металдық күйін жылдам анықтау.» 105.21 физикалық шолу хаттары (2010): 217401.
  22. ^ Dong, C. Y. және т.б. «Асинхронды сорғы-зондты микроскопия арқылы флуоресценттік өмірді бейнелеу.» Биофизикалық журнал 69.6 (1995): 2234-2242.
  23. ^ Пилетик, Иван Р., Томас Э. Мэтьюз және Уоррен С. Уоррен. «Эумеланиндер мен феомеланиндердегі инфрақызылға жақын фоторелаксация жолдарын зондтау.» Физикалық химия журналы A 114.43 (2010): 11483-11491.
  24. ^ Мэттьюс, Томас Э. және т.б. «In vivo және ex vivo эпи режиміндегі меланин мен микроваскуляцияны сорғы-зондпен бейнелеу». Биомедициналық оптика Express 2.6 (2011): 1576-1583.
  25. ^ Виллафана, Тана Элизабет және т.б. «Фемтосекундтық зондты микроскопия тарихи өнер туындыларында виртуалды қималарды қалыптастырады.» Ұлттық ғылым академиясының еңбектері 111.5 (2014): 1708-1713.
  26. ^ Саминени, Пратюш және т.б. «Суреттерде қолданылатын тарихи пигменттерді сорғы-зонд арқылы бейнелеу». Оптика хаттары 37.8 (2012): 1310-1312.